CELL DAMAGE DETECTION USING ESCHERICHIA COLI REPORTER PLASMIDS: FLUORESCENT AND COLORIMETRIC ASSAYS

Abstract

Los ensayos con periodistas bacterianos son potentes herramientas utilizadas para estudiar el efecto de diferentes compuestos que afectan la fisiología de los procesos celulares. La mayoría de los reporteros bacterianos están basados en luciferasa y pueden ser monitoreados en tiempo real. En el presente estudio hemos diseñado e implementado dos series de Escherichia coli bacteriana para reportar ensayos, utilizando un sistema de plásmido multicopia. Cada cepa informadora se construyó usando proteínas fluorescentes verdes o proteínas de β-galactosidasa (LacZ). Las cepas informadoras diseñadas son capaces de responder de una manera específica a las moléculas ya sea el estrés oxidativo, o membrana, proteína o daño del ADN. Con el fin de responder al estímulo deseado, se usaron secuencias promotoras de E. coli. Estas secuencias corresponden al promotor de la catalasa mayor (KatG) activada con daño oxidativo celular, el promotor de la deshidrasa β-hidroxidecanoil-ACP (FabA) que se activa con perturbación de membrana, el promotor de ADN recombinasa (RecA) que se activa por lesiones de ADN. Para el repliegue erróneo de proteínas, se utilizó el promotor del chaperón sensible al choque térmico (DnaK). Nuestros constructos mostraron la activación de daño de estímulos específicos, y la baja respuesta a los estímulos no específicos se detectó. Nuestros resultados sugieren que estos tipos de cepas de reportero bacteriano pueden ser utilizados en estudios semicuantitativos (fluorométricos) y cualitativos (actividad β-galactosidasa) de diferentes sustancias xenobióticas y contaminantes.